引言：近日，國家藥監(jiān)總局醫(yī)療器械技術審批中心發(fā)布《地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術審查指導原則（征求意見稿）》，就該醫(yī)療器械注冊審評相關事項面向社會公眾公開征求意見。

根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局2019年度醫(yī)療器械注冊技術指導原則制修訂計劃的有關要求，我中心組織起草了《地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術審查指導原則》。經(jīng)文獻匯集、企業(yè)調(diào)研、專題研討和專家討論，形成了征求意見稿。

為使該指導原則更具有科學合理性及實際可操作性，即日起在網(wǎng)上公開征求意見，衷心希望相關領域的專家、學者、管理者及從業(yè)人員提出意見或建議，推動指導原則的豐富和完善。

請將意見或建議以電子郵件的形式于2019年11月10日前反饋我中心。

聯(lián)系人：劉容枝、韓從音

電話：010-86452532；010-86452531；

電子郵箱：liurz@cmde.org.cn
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附件：1. 地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術審查指導原則（征求意見稿）（下載）

    2. 反饋意見表（下載）

國家藥品監(jiān)督管理局

醫(yī)療器械技術審評中心

2019年10月18日

附件1

地中海貧血基因突變檢測試劑注冊技術審查指導原則

（征求意見稿）

本指導原則旨在指導醫(yī)療器械注冊申請人對地中海貧血基因突變檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對地中海貧血基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究和驗證資料，相關人員應在遵循法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、范圍

地中海貧血（簡稱地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發(fā)生突變（點突變或缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無臨床表現(xiàn)，重者以進行性溶血性貧血為主要特征。根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，地貧分為α，β和γ地貧等，臨床上最常見的是α和β地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數(shù)非洲地區(qū)，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國南方地區(qū)最常見、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧人群攜帶率可達10%以上，廣西更是達到了20%以上。

α地貧主要是由于α-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起。α珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括2個胎兒期和成人期表達基因（α2和α1），基因的排列順序為5’-α2-α1-3’。根據(jù)單倍型的情況，可將α地貧分為3類：（1）缺失型α⁺地貧（-α/），缺失1個α基因；（2）缺失型α⁰地貧（--/），2個α基因同時缺失；（3）非缺失型α⁺地貧（α^Tα/或αα^T/），1個α1或α2基因發(fā)生點突變或少數(shù)幾個堿基的缺失。中國現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少19種α珠蛋白基因大片段缺失和38種α珠蛋白基因點突變。其中，6種α珠蛋白基因突變：--^SEA/、-α^3.7/、-α^4.2/、α^WSα/（HBA2:c.369C>G）、α^QSα/（HBA2:c.377T>C）；α^CSα/（HBA2:c.427T>C）占患病人群總數(shù)的98%。

α地貧基因型和臨床分型的關系已經(jīng)基本闡明。α地貧的表型嚴重程度隨著功能性α珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個α基因缺失或點突變（-α/αα或αα^T/αα或α^Tα/αα），稱為靜止型α地貧，通常不貧血，血液學表現(xiàn)為小細胞低色素；（2）2個α基因缺失或復合α基因點突變，或點突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/αα^T或α^Tα/-α或α^Tα/α^Tα，稱為輕型α地貧，臨床表現(xiàn)α地貧特征，血液學檢查有小細胞低色素特征；（3）3個α基因缺失或復合α基因點突變，基因型為--/-α或--/α^Tα，稱為中間型α地貧，又稱Hb H病，患者有中重度貧血。某些基因型為α^Tα/α^Tα的病例（如α^CSα/α^CSα、α^QSα/α^QSα和α^CSα/α^QSα）也表現(xiàn)為Hb H病。通常，--/α^Tα的非缺失型 Hb H病較單純?nèi)笔?/span>Hb H病（--/-α）的臨床表現(xiàn)更為嚴重，特別是基因型為--/α^CSα或--/α^QSα的Hb H病患者，貧血程度較為嚴重；（4）4個基因缺失，其基因型為--/--，稱為重型α地貧，又稱Hb Bart’s胎兒水腫綜合征，此類個體一般無法存活到出生或分娩后半小時內(nèi)死亡。

β地貧是由于β珠蛋白基因發(fā)生點突變或缺失而引起，以點突變?yōu)橹鳎贁?shù)為缺失型。β珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個成人期表達基因（β和δ），基因的排列順序為5’-δ-β-3’。根據(jù)β珠蛋白鏈合成量的程度，可將β地貧分為3類：（1）β⁰地貧，β珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱為β⁰地貧等位基因；（2）β⁺地貧，β珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱為β⁺地貧等位基因；（3）β⁺⁺地貧，又稱沉默型β地貧，β珠蛋白鏈合成輕微減少。中國已報道84中β珠蛋白基因點突變和11種β珠蛋白基因缺失。其中，6種點突變：HBB:c.126_129delCTTT，HBB:c.52A>T，HBB:c.-78A>G，HBB: c.79G>A，HBB: c.316-197C>T和HBB: c.216_217insA占了全部突變類型的90%以上。

β地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β地貧，基因型為β⁺⁺/β^N，血液學表型正?；蚺R界，一般只能通過分子診斷識別；（2）輕型β地貧，基因型為β⁰/β^N或β⁺/β^N，臨床表現(xiàn)為小細胞低色素和HB A2值升高；（3）中間型β地貧，基因型為β⁺/β⁺或β⁺/β⁰，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現(xiàn)中度貧血；（4）重型β地貧，基因型為β⁺/β⁰或β⁰/β⁰，通常伴有嚴重貧血，需要定期輸血才能存活?；純撼錾鷷r無癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發(fā)病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎較為復雜，顯性β地貧突變的雜合子（β^D/β^N），合并α地貧突變的β地貧突變純合子（β⁰/β⁰），或合并α珠蛋白三聯(lián)體的β地貧突變雜合子（β⁰/β^N或β⁺/β^N），也會顯示中間型的表型。

2018年發(fā)布的《重型β地中海貧血的診斷和治療指南》明確規(guī)定：對于重型β地中海貧血的診斷，有條件者均應進行基因診斷，基因型為純合子或復合雜合子為確診本病的指標。2018年發(fā)布的《兒童非輸血依賴型地中海貧血的診治和管理專家共識》也明確規(guī)定：地貧基因檢測為非輸血依賴型地貧的診斷依據(jù)之一。

另外，國家衛(wèi)生計生委發(fā)布的相關文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國地貧高發(fā)省份實施地貧防控試點項目。主要流程包括：（1）對新婚夫婦和計劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進行血常規(guī)常規(guī)初篩；（2）對夫婦一方或雙方血常規(guī)檢查結果陽性的夫婦進行血紅蛋白分析復篩；（3）對血紅蛋白分析復篩結果均為陽性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進行相應的α+β地貧基因檢測；（4）綜合夫婦雙方病史詢問、地貧篩查和基因檢測結果，判定為高風險夫婦。對高風險夫婦進行追蹤，及時了解受檢婦女懷孕情況，指導女方在懷孕后適宜時期接受產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷的對象為胎兒，樣本類型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測項目為相應的β地貧基因檢測。

綜上，結合該類產(chǎn)品臨床使用的實際情況，本指導原則的預期用途可為：用于體外定性檢測人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α和/或β地貧基因突變或缺失，用于：α和/或β地貧的遺傳診斷，或地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷。

結合該類產(chǎn)品在中國注冊的實際情況以及當前的認知，本指導原則僅對“α和/或β地貧的遺傳診斷”預期用途的相關內(nèi)容進行了詳細闡述。針對其他兩個預期用途，本指導原則僅對部分內(nèi)容進行了闡述，申請人應根據(jù)產(chǎn)品特性，對本指導原則未涉及的內(nèi)容進行補充評價。

本指導原則的技術要求是基于PCR探針法方法建立的，對于其他分子生物學檢測技術（如：PCR-反向點雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及國內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢驗原理、檢測的缺失和/或突變類型以及臨床意義等方面詳細說明申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號），以下簡稱《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應成分、質控品及企業(yè)參考品的研究資料。

1. 此類產(chǎn)品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTP、反應緩沖液等。申請人應提交相關原材料的選擇、制備和質量標準等的研究資料。如為申請人自制，應提交詳細的工藝穩(wěn)定性研究資料；如為外購，還應提交供應商篩選資料以及供應商提供的原材料質量檢定報告。

1.1 核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

1.2 引物、探針

申請人應詳述引物、探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計多套引物探針以供篩選，針對待測位點的特異性等進行評價，選擇最佳設計，并提交詳細的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進行質量評價，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以及功能性試驗等，并依據(jù)評價結果建立合理的質量標準。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

1.4脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質量標準。

2. 質控品

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒質控品來實現(xiàn)。

質控品可分別設置野生型、雜合型及純合突變型DNA樣品（至少包含代表性的突變類型和突變位點），同時設置不含待測靶序列的空白質控品用于交叉污染的質控；也可直接采用常見突變類型和突變位點的雜合型樣品及空白質控品進行質量控制。

如該類產(chǎn)品所采用的方法學和檢驗原理顯示：無論檢測何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應體系均可出現(xiàn)陽性反應，均可對管內(nèi)抑制導致的假陰性結果進行質量控制，則無需另外設置內(nèi)標；否則，試劑盒應另外設置內(nèi)標。

質控品可采用質?；蛉嘶蚪MDNA等?？瞻踪|控品應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供質控品原料選擇、制備、定值過程等的詳細研究數(shù)據(jù)，并對質控品的檢測結果做出明確的范圍要求。

3. 企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和精密度參考品等。申請人應提交企業(yè)參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的詳細研究資料等。

3.1 陽性參考品：可采用臨床樣本或其核酸提取液，如采用臨床樣本，則樣本類型應與待測樣本一致。應至少包含野生型和所有檢測位點的雜合型樣本，同時盡量納入純合突變型樣本。對于某些稀有基因型，需要時也可采用細胞系代替。

3.2 陰性參考品：應考慮檢測特異性的評價，納入易產(chǎn)生交叉反應的同源序列樣本和干擾樣本等。

3.3檢測限參考品可選擇最低檢測限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸提取液，至少包含所有檢測位點的雜合型樣本。

3.4 精密度參考品應至少包括所有檢測位點的低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸提取液。

目前，該類產(chǎn)品已有國家參考品，企業(yè)參考品的要求應不低于國家參考品。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記（如有）等工藝過程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過程應對關鍵參數(shù)進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。

反應體系研究指反應條件的選擇確定過程，包括樣本采集、預處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應條件、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）等的確定。

不同適用機型的反應條件如有差異應分別提交。

（四）分析性能評估資料

申請人應針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗地點、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、試驗方法、試驗樣本（類型、來源、數(shù)量、處理方法、基因型和濃度確認等）、可接受標準、統(tǒng)計方法、試驗數(shù)據(jù)及結論等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內(nèi)外有關體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導原則。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對于某些稀有基因型，也可采用細胞系等。

1. 核酸提取/純化性能（如有）

在進行靶核酸檢測前，應有適當?shù)暮怂崽崛?/span>/純化步驟。該步驟應最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗證，并評價該方法能否滿足該類產(chǎn)品的要求。

2. 檢測準確性

建議采用若干份臨床樣本驗證該類產(chǎn)品的檢測準確性，樣本類型與說明書聲稱的樣本類型一致。樣本應涵蓋野生型、所有檢測位點的雜合突變型和純合突變型。對于某些稀有基因型，也可采用細胞系代替。

3. 最低檢測限

該類產(chǎn)品的最低檢測限可定義為：在滿足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標序列的最低人基因組DNA的濃度。可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復檢測，確定適當檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測限評價建議采用臨床樣本或細胞系，并至少包含所有檢測位點的雜合突變型。應明確臨床樣本或細胞系與人基因組DNA濃度的對應關系。

4. 分析特異性

4.1 應針對同源序列進行交叉反應驗證，說明交叉反應樣本的制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

4.2 應針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等；

干擾試驗可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質的方式，評價干擾物質對目標序列檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進行評價；如有干擾，應確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

5. 精密度

精密度評價應采用臨床樣本進行試驗，試驗操作完全按照說明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。樣本應至少涵蓋所有檢測位點的雜合突變型。

精密度評價需滿足如下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑本身外，還包括分析儀、操作者、地點、時間、檢測輪次和試劑批次等。

5.2設定合理的精密度評價周期，對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間重復性進行評價。

5.3用于精密度評價的臨床樣本至少設置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標可設置為CV等，申請人應對精密度指標評價標準做出合理要求。

（五）陽性判斷值確定資料

建議納入一定數(shù)量的臨床樣本，應包括所有檢測位點的各種基因型（野生型、雜合突變型和純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法確定陽性判斷值。

如試劑判讀存在灰區(qū)，應解釋說明灰區(qū)范圍的確定方法。

對于某些檢測方法學，陽性判斷值研究可能不適用，申請人應說明理由。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要包括申報產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究和適用樣本的穩(wěn)定性研究兩部分。前者主要包括申報產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、開瓶/復溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時間等的研究。

實時穩(wěn)定性研究應采用至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產(chǎn)品性能評價，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

（七）臨床試驗

應滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說明該類產(chǎn)品臨床試驗中應關注的重點問題。

（一）針對“α和/或β地貧的遺傳診斷”預期用途

1．臨床試驗機構及人員

申請人應根據(jù)產(chǎn)品特點及預期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗機構開展臨床試驗。

2. 臨床試驗適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征、血液學表現(xiàn)為小細胞低色素的疑似地貧患者；需與地貧進行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細胞性貧血或先天性紅細胞生成異常性貧血等。

臨床試驗所用樣本應為臨床外周抗凝靜脈全血臨床樣本，基因組DNA非臨床樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應同時滿足申報產(chǎn)品說明書、對比試劑說明書（如適用）及第三方試劑說明書（如適用）的相關要求。

3. 臨床試驗方法

3.1已有同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

對于已批準的α地貧突變或缺失（α^CS、α^QS、α^WS、--^SEA/、-α^3.7和-α^4.2/Thai）以及β地貧突變或缺失（41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、14-15M、27/28M、31M、37M、43M、-29M、-30M、-32M、-50M/N、IntM、IVS-I-1M、IVS-I-5M），選擇已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑，評價申報產(chǎn)品的臨床檢測性能。

3.2無同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

3.2.1 如新突變位點的臨床意義已獲行業(yè)認可（如：國內(nèi)相關指南或專家共識），且上述認可基于充分的中國人群的臨床數(shù)據(jù)，則臨床試驗可選擇sanger基因測序（針對新的點突變）或臨床普遍使用的其他公認方法（針對其他類型的新突變位點，如缺失）作為對比方法，評價新突變位點的臨床檢測性能。除此之外，還應提交新位點臨床意義已獲行業(yè)認可的相關證據(jù)，但該部分資料可不納入臨床方案和報告。

3.2.2 如新突變位點的臨床意義未獲行業(yè)認可，則臨床試驗應包括兩個目的，新突變位點的臨床檢測性能評價和臨床意義的評價。新突變位點的臨床檢測性能評價可參考3.2.1；新突變位點臨床意義的評價應提交基于中國人群的充分的臨床證據(jù)，證明基因型與表型的關系，如：隨訪或其他可證明基因型與表型關系的臨床驗證資料。該部分新突變位點臨床意義的評價應納入臨床方案和報告。

4. 最低樣本量和陽性例數(shù)

臨床試驗樣本量應采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法進行估算，并詳細描述所使用統(tǒng)計方法及各參數(shù)的確定依據(jù)。

4.1 臨床檢測性能評價的樣本量估算

臨床檢測性能評價的樣本量估算，建議采用單組目標值法計算臨床試驗的最低樣本量，通過陽性符合率計算所需陽性樣本的例數(shù)，通過陰性符合率計算所需陰性樣本的例數(shù)，同時考慮脫落情況，計算最低樣本總量。陽性符合率和陰性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）建議均不低于98%。

所有突變位點應均具有適當數(shù)量的陽性例數(shù)，常見突變位點的陽性例數(shù)應分別滿足統(tǒng)計學要求，罕見突變位點也應有一定的陽性例數(shù)，以便臨床性能得到充分驗證。

4.2 新位點臨床意義評價的樣本量估算

新位點臨床意義評價的樣本量估算，建議采用抽樣調(diào)查公式或其他合理方法進行估算。

（二）針對“地貧高風險夫婦的評估”和“胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷”預期用途

針對上述兩個預期用途，本指導原則僅對部分內(nèi)容進行了闡述，申請人應根據(jù)產(chǎn)品特性，充分考慮本指導原則未涉及的內(nèi)容，設計科學合理的臨床試驗進行評價。

1.      臨床試驗機構和人員

如申報產(chǎn)品的預期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，臨床試驗機構還應為已取得產(chǎn)前診斷技術服務資質的醫(yī)療機構。人員應為經(jīng)過專門培訓的取得資質的人員。機構和人員應遵循《產(chǎn)前診斷技術管理辦法》《母嬰保健專項技術服務許可及人員資格管理辦法》，機構取得《母嬰保健技術服務執(zhí)業(yè)許可證》，人員取得《母嬰保健技術考核合格證書》。

2、臨床試驗適用人群和臨床樣本

如預期用途為地貧高風險夫婦的評估，則適用人群為：地貧表型篩查陽性，或需進行地貧基因檢測的其他人群（主要為地貧高發(fā)地區(qū)計劃懷孕夫婦）。

如預期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風險夫婦的胎兒。地貧高風險夫婦的確定可參考衛(wèi)技委等相關文件。

臨床試驗所用樣本應為胎兒羊水等臨床樣本，基因組DNA非臨床樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應符合衛(wèi)計委等相關文件的要求，并同時滿足產(chǎn)品說明書的要求。

3. 最低樣本量和陽性例數(shù)

針對兩種不同的預期用途，應分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預期用途的不同樣本類型（羊水和臍帶血等），也應分別采用合理方法估算最低樣本量。

（三）不同預期用途的通用要求

1. 臨床試驗方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

1.1應在臨床試驗方案或報告中明確申報產(chǎn)品、對比試劑和第三方試劑的試驗方法。

1.2臨床試驗病例總結表應以列表方式表示，包括申報產(chǎn)品的結果、對比試劑的結果、第三方試劑的檢測結果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

1.3以交叉表分別總結兩種試劑的定性檢測結果，選擇合適的統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析，以驗證兩種試劑檢測結果的一致性。

1.4 結果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，采用合理方法進行復核，并對差異原因進行分析。如無需復核，應說明理由。

2. 臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結果判定時，應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。另外，申報產(chǎn)品的樣本類型不應超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

3. 臨床試驗報告

應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。

（八）產(chǎn)品技術要求

產(chǎn)品技術要求應符合《辦法》、《44號公告》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的相關要求。該類產(chǎn)品作為三類體外診斷試劑，應將主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求等內(nèi)容作為附錄附于技術要求正文后。

目前，該類產(chǎn)品已有行業(yè)標準，產(chǎn)品技術要求的相關要求應不低于行業(yè)標準的要求。

（九）產(chǎn)品檢驗報告

根據(jù)《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請注冊時應提交連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的檢驗報告。目前，該產(chǎn)品已有國家參考品，產(chǎn)品注冊檢驗應滿足國家參考品的要求。

（十）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應與申請人提交的注冊申報資料的相關研究結果保持一致。下面對該類產(chǎn)品說明書的重點內(nèi)容進行闡述。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于定性檢測人xx樣本基因組DNA中的α和/或β地貧xx突變或xx缺失，用于：α和/或β地貧的遺傳診斷，或地貧高風險夫婦的評估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關的臨床背景信息及實驗室診斷方法等、介紹被測靶標（基因缺失或/和突變位點）的相關情況。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應列出相關試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經(jīng)過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號和醫(yī)療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒的被測靶標進行詳細描述（基因位置、缺失或/和突變位點及相關特征等），對試劑盒所用探針、引物、突變或缺失的判定終點等進行詳細介紹；對不同樣本反應管組合、質控品設置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環(huán)節(jié)進行合理質控，明確提取核酸的濃度純度等質量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設置、循環(huán)數(shù)設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6儀器設置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標記情況、對待測樣本及其他質控品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結果的解釋】

結合質控品、樣本管檢測結果以及檢測類型，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結果及相應的解釋。如存在檢測灰區(qū)，應詳述對于灰區(qū)結果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產(chǎn)品僅對下述檢測類型xx進行了驗證。

9.2有關假陰性結果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結果。

9.2.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標】簡述以下性能指標：

10.1最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結果。

10.2陽性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應驗證：同源性序列等交叉反應驗證。

10.4.2干擾物質驗證：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

10.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結果。

11.【注意事項】應至少包括以下內(nèi)容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》現(xiàn)行有效版本等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。