引言：自2019年新型冠狀病毒（以下簡(jiǎn)稱新冠）被發(fā)現(xiàn)以來，新冠疫情在全世界持續(xù)蔓延，全球感染例數(shù)不斷攀升。為有效應(yīng)對(duì)疫情，世界各國(guó)都在加緊新冠疫苗的研發(fā)，到目前為止，美國(guó)、英國(guó)、中國(guó)、歐盟等國(guó)家和地區(qū)，已相繼批準(zhǔn)多個(gè)疫苗用于人群接種。

在疫苗臨床有效性的評(píng)價(jià)中，疫苗保護(hù)效力（即評(píng)價(jià)接種疫苗后所預(yù)防疾病的發(fā)病率下降百分比）是最為關(guān)鍵的評(píng)價(jià)指標(biāo)。同時(shí)，中和抗體的檢測(cè)對(duì)于評(píng)價(jià)疫苗接種后人體免疫應(yīng)答水平等也起到非常重要的作用。這里所說的中和抗體檢測(cè)主要指基于體外培養(yǎng)病毒進(jìn)行的中和試驗(yàn)。

伴隨著疫苗的研究和上市，多家研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)致力于采用體外診斷試劑進(jìn)行中和抗體檢測(cè)的研究，且預(yù)期用途與疫苗有效性評(píng)價(jià)有關(guān)。體外診斷試劑能否進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，能否用于疫苗效果評(píng)價(jià)等相關(guān)問題引發(fā)了行業(yè)高度的關(guān)注和討論。我中心針對(duì)這一問題進(jìn)行了多次調(diào)查研究，并召開專家研討會(huì)，征求相關(guān)行業(yè)專家意見。參與討論的專家包括了疫苗研發(fā)、疫苗評(píng)價(jià)、中和抗體試驗(yàn)研究和評(píng)價(jià)、臨床醫(yī)生、傳染病預(yù)防控制、臨床檢驗(yàn)等各個(gè)相關(guān)領(lǐng)域的專家?，F(xiàn)將目前調(diào)研結(jié)果總結(jié)如下。

一、新冠中和抗體的作用機(jī)制及主要類型：

中和抗體是由病毒最外層的包膜或衣殼抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的一類能與病毒結(jié)合并使之喪失感染力的抗體。病毒侵入人體后，體內(nèi)漿細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生病毒特異性抗體，其中只有一部分是中和抗體。

中和抗體作用機(jī)制一般包括改變病毒表面構(gòu)型；與吸附有關(guān)的病毒表位結(jié)合，阻止病毒吸附，使病毒不能侵入細(xì)胞進(jìn)行增殖；與病毒形成免疫復(fù)合物，易被巨噬細(xì)胞吞噬清除；有包膜病毒的表面抗原與中和抗體結(jié)合后，激活補(bǔ)體，可導(dǎo)致病毒的溶解。

目前針對(duì)新冠病毒的中和抗體是研究的熱點(diǎn)，不同的研究小組應(yīng)用各種篩選方法篩選出大量針對(duì)新冠病毒的中和抗體，這些抗體大致可以分為以下幾類：

1.針對(duì)S1蛋白的受體結(jié)合域（RBD）

針對(duì)S1蛋白R(shí)BD的中和抗體可以與新冠病毒RBD區(qū)域結(jié)合，阻斷RBD與ACE2受體結(jié)合，從而阻斷病毒侵入人體細(xì)胞。針對(duì)RBD的中和抗體是人體產(chǎn)生的最主要、種類最多、對(duì)病毒阻斷活性最高的一類抗體。

2.針對(duì)S1蛋白的N末端域（NTD）

有些中和抗體針對(duì)S1蛋白NTD區(qū)域，比如4A8等，能有效地中和新冠病毒。2021年1月發(fā)表于Cell Research的一項(xiàng)研究顯示，人體細(xì)胞上的酪氨酸蛋白激酶受體UFO（AXL）與NTD區(qū)域特異性結(jié)合，可能是潛在的病毒感染細(xì)胞的受體，此項(xiàng)研究結(jié)論可以部分解釋NTD中和抗體能夠有效中和新冠病毒的原理。

3.其他

有研究報(bào)道了多株針對(duì)S1蛋白的中和抗體，但不能與RBD重組蛋白結(jié)合，也不識(shí)別NTD結(jié)構(gòu)域，其中和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另有研究表明新冠肺炎康復(fù)者血漿存在能結(jié)合S2蛋白的抗體，相關(guān)研究報(bào)道較少。

綜上，中和抗體阻斷病毒感染可有多種途徑；目前的研究證實(shí)，針對(duì)新冠病毒的中和抗體可能的結(jié)合位點(diǎn)涉及多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，且不排除還有新的未被發(fā)現(xiàn)的結(jié)合位點(diǎn)。

二、中和抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”

中和抗體檢測(cè)是疫苗研發(fā)和臨床評(píng)價(jià)過程中重要的指標(biāo)之一，中和抗體檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室金標(biāo)準(zhǔn)是感染抑制試驗(yàn)，主要包括利用活病毒進(jìn)行的蝕斑減少中和試驗(yàn)（plaque reduction neutralization test，PRNT）和通過檢測(cè)細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）量來進(jìn)行分析的微量細(xì)胞中和試驗(yàn)。這兩種方法均使用定量的活病毒與不同稀釋度的等量血清混合后，接種預(yù)先準(zhǔn)備好的單層細(xì)胞，通過不同的指標(biāo)評(píng)價(jià)細(xì)胞的病變程度評(píng)價(jià)中和抗體效價(jià)。采用體外培養(yǎng)的活病毒進(jìn)行的中和試驗(yàn)反映的是人體血液樣本中能夠阻斷病毒感染的總中和抗體的效價(jià)。

中和抗體檢測(cè)方法需要經(jīng)過嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化過程和充分的性能評(píng)價(jià)，并通過確定適合的判斷界值（Cut-off值），建立與病毒保護(hù)力之間的相關(guān)性，確定最低保護(hù)水平。例如已經(jīng)較為成熟的流感疫苗、EV71疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗等，均已建立了WHO認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)化的中和抗體試驗(yàn)，有相應(yīng)的WHO標(biāo)準(zhǔn)品和推薦使用的標(biāo)準(zhǔn)毒株，并設(shè)定了明確的Cut-off值。其他疫苗，即使尚沒有國(guó)際公認(rèn)的參考方法，各疫苗廠商也需要建立相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的中和抗體試驗(yàn)方法。

此外，對(duì)于新發(fā)突發(fā)烈性病毒性傳染病來講，由于活病毒株來源以及需在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作的限制，越來越多的實(shí)驗(yàn)室開始研發(fā)假病毒細(xì)胞培養(yǎng)的方法檢測(cè)中和抗體，該方法中假病毒的膜蛋白結(jié)構(gòu)與活病毒相似，且不需要高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷客觀；但該方法同樣需要標(biāo)準(zhǔn)化且應(yīng)與活病毒培養(yǎng)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

專家廣泛認(rèn)為，以上PRNT、CPE和假病毒中和試驗(yàn)是病毒疫苗評(píng)價(jià)中最常用且最經(jīng)典的三種中和抗體檢測(cè)方法。方法學(xué)可靠，但需嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化過程。

針對(duì)新冠病毒，國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)都在致力于研究基于活病毒或假病毒的中和抗體檢測(cè)方法，其中也包括WHO的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，但由于新冠疫苗研發(fā)的周期較為有限，相關(guān)基礎(chǔ)研究仍然不夠，加之突變株的不斷出現(xiàn)，到目前為止還沒有建立起標(biāo)準(zhǔn)化的中和抗體試驗(yàn)方法；各家機(jī)構(gòu)建立的試驗(yàn)方法之間也存在不小的差異。

三、基于酶聯(lián)免疫等方法的中和抗體檢測(cè)試劑研發(fā)情況

目前，國(guó)內(nèi)外很多科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)將中和抗體檢測(cè)試劑作為研發(fā)方向，進(jìn)行了很多探索。一般是基于單抗原表位或多抗原表位采用競(jìng)爭(zhēng)抑制原理的酶聯(lián)免疫法進(jìn)行中和抗體檢測(cè)。產(chǎn)品擬定預(yù)期用途與疫苗接種后有效性評(píng)價(jià)有關(guān)。

針對(duì)此類產(chǎn)品的研發(fā)和臨床定位尚存在以下主要問題：

1.試劑需要選擇一個(gè)或多個(gè)抗原表位進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，而抗原表位的選擇決定了檢測(cè)到的抗體是否中和抗體，以及能夠起到保護(hù)作用的中和抗體是否都被充分檢測(cè)到了。目前新冠病毒的基礎(chǔ)研究尚不充分，中和抗體可能涉及病毒表面的多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域；且有研究表明在疫苗接種后的不同時(shí)間階段，中和抗體譜可能會(huì)發(fā)生變化，例如中和抗體中RBD抗體和NTD抗體的比例可能發(fā)生變化；同時(shí)病毒抗原表位的變異頻頻出現(xiàn)，且規(guī)律尚不明確。因此，無(wú)論是單個(gè)表位還是多個(gè)表位的檢測(cè)產(chǎn)品，均不能確保覆蓋所有中和抗體。且不同的疫苗在工藝路線上的差異，導(dǎo)致產(chǎn)生的中和抗體也不同，這些差異帶來的不確定性使得試劑在中和抗體表位的選擇上很難達(dá)到很好的代表性和覆蓋程度。

2.體外檢測(cè)中和抗體的濃度值與疫苗保護(hù)效力的相關(guān)性尚缺乏充分的臨床證據(jù)，無(wú)法建立可靠的Cut-off值。在沒有可靠的Cut-off值的情況下，試劑檢測(cè)結(jié)果很難用于描述疫苗的保護(hù)力，不能給臨床提供有明確價(jià)值的判斷和結(jié)果提示，即陽(yáng)性不代表一定有保護(hù)力，而陰性或弱陽(yáng)性也不能說明一定沒有保護(hù)力。

現(xiàn)階段已經(jīng)有一些正在研究的項(xiàng)目，試圖采用建立的體外診斷試劑與體外培養(yǎng)活病毒的中和試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比研究，從而建立一個(gè)有效的Cut-off值，確立體外診斷試劑檢測(cè)中和抗體的性能。但是，此類研究中所采用的對(duì)照方法“體外培養(yǎng)病毒的中和試驗(yàn)”尚且沒有建立公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，因此比較研究的結(jié)論缺乏可溯源和可協(xié)調(diào)一致的基礎(chǔ)。

可見基于現(xiàn)階段的研究情況，體外診斷試劑檢測(cè)中和抗體無(wú)論是在方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化方面還是Cut-off值建立方面都缺乏充分的研究和論證。

3.體液免疫并不是疫苗接種后產(chǎn)生保護(hù)力的唯一途徑，除了中和抗體（體液免疫）之外，細(xì)胞免疫等其他免疫途徑也同時(shí)發(fā)揮作用。因此接種疫苗后中和抗體滴度水平低或者檢測(cè)陰性，并不能明確得出沒有保護(hù)力的結(jié)論。對(duì)疫苗保護(hù)力的評(píng)價(jià)應(yīng)結(jié)合體液免疫與細(xì)胞免疫等進(jìn)行綜合判斷。

4.疫苗評(píng)價(jià)是從群體的角度判斷能否實(shí)現(xiàn)一定的保護(hù)率，從傳染病防控的角度證明疫苗能夠有效阻斷病毒的傳播，而不是針對(duì)每一個(gè)個(gè)體判斷疫苗是否有效。保護(hù)力的研究結(jié)論來自疫苗上市前及上市后大規(guī)模的臨床研究數(shù)據(jù)。因此在沒有充分?jǐn)?shù)據(jù)支持、且新冠疫苗免疫機(jī)理研究及中和抗體中和機(jī)制研究尚不透徹的情況下，針對(duì)疫苗接種個(gè)體進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，既不能給疫苗評(píng)價(jià)提供有效的支持，也不能給接種者個(gè)體提供有效的信息，不具備顯著的必要性。

四、小結(jié)

綜上，在疫苗研發(fā)和有效性評(píng)價(jià)的過程中，各種中和抗體檢測(cè)替代方法的科學(xué)研究值得鼓勵(lì)；但是，作為體外診斷試劑管理的產(chǎn)品上市，應(yīng)當(dāng)建立在充分的基礎(chǔ)研究成果和充分的臨床證據(jù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)當(dāng)符合法規(guī)規(guī)定的定義和用途。

標(biāo)簽：體外診斷試劑注冊(cè)、體外診斷試劑生產(chǎn)許可證代辦、體外診斷試劑CE認(rèn)證代辦